草酸诱导HK-2细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体3炎症小体的激活在草酸钙肾结石形成中的作用及机制

摘要：目的 探讨高浓度草酸作用于人肾小管上皮细胞HK-2后核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)炎症小体在草酸钙肾结石形成过程中的激活作用机制.方法 通过测定细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)的含量、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法分析草酸对HK-2细胞的毒性及损伤;使用相差显微镜观察高浓度草酸作用于HK-2细胞后细胞表面晶体黏附;通过Westernblot法和实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)分别检测高浓度草酸作用于HK-2细胞后NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)及白细胞介素-1β(IL-1β)蛋白和mRNA表达量的影响,同时检测高浓度草酸作用于HK-2细胞后对透明质酸合酶1(HAS1)、透明质酸合酶2(HAS2)、透明质酸合酶3(HAS3)、骨桥蛋白(OPN)以及CD44mRNA表达的影响,并采用二氯荧光黄二乙酸酯(DCFH-DA)检测活性氧自由基(ROS);Western blot和FQ-PCR法分别检测使用ROS抑制剂N-乙酰基半胱氨酸(NAG)预处理HK-2细胞后高浓度草酸作用于细胞后NLRP3的蛋白及mRNA的表达水平变化;使用RNA干扰技术,将NLRP3-小干扰RNA(siRNA)和阴性对照(NC)转染HK-2细胞后,相差显微镜观察晶体黏附变化,FQ-PCR法分别检测HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA表达水平变化.结果 使用不同浓度的草酸处理HK-2细胞24h,测定LDH含量结果显示当草酸浓度为0.8 mmol/L时,细胞培养基中LDH开始比草酸浓度为0.6 mmol/L时显著增加[(528.37±25.65)比(300.55±17.18) mmol/L,P=0.001],DAPI染色法显示不同浓度草酸侧细胞数量分别为:55.67±3.30、52.33 ±6.13、52.33±2.05、58.00±9.09、50.00±1.63、47.33±2.05、33.67±3.30、20.33±2.05,当草酸浓度为1.0 mmol/L时,细胞数量开始比草酸浓度为0.8mmol/L时明显减少(33.67±4.04比47.33±2.52,P=0.008);相差显微镜观察高浓度草酸+一水草酸钙(COM)作用于HK-2细胞后晶体黏附数量明显多于对照组[(7.34±0.82)％比(5.29±0.73)％,P=0.001];高浓度草酸作用于HK-2细胞后24 h,通过Western blot和FQ-PCR发现,NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白水平(1.82±0.04比1.00±0.02,P=0.000;1.62±0.23比1.00±0.06,P=0.021;1.37±0.16比1.00±0.18,P=0.029)和mRNA表达(1.29±0.24比0.84 ±0.11,P=0.011;2.16 ±0.29比1.04±0.14,P =0.009;1.80±0.02比1.00±0.15,P=0.002)均分别高于对照组,且HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CI44 mRNA(1.35 ±0.25比0.81 ±0.11,P =0.049;2.46 ±0.29比0.84 ±0.14,P =0.002;0.90±0.02比0.60±0.15,P=0.039;1.68±0.27比1.00±0.22,P=0.049;2.03±0.47比1.00±0.15,P =0.040)表达水平亦均高于对照组;采用DCFH-DA检测ROS,发现草酸可引起细胞内发生氧化应激产生ROS(736.67±80.21比208.67±35.73,P=0.001),并且ROS抑制剂NAC作用后NLRP3的蛋白表达水平明显降低(1.53±0.31比4.50±0.40,P=0.001),而空白组与NAC组分别为0.90±0.10比1.00 ±0.26(P =0.288);与NC组比较,NLRP3-siRNA组细胞表面晶体黏附数量显著减少[(1.87±0.21)％比(3.57±0.12)％,P=0.003],且细胞内HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44mRNA(1.06±0.07比2.44 ±0.47,P=0.015;0.87±0.07比1.48 ±0.22,P=0.021;1.24±0.16比1.72±0.10,P=0.026;1.03 ±0.15比1.45±0.09,P=0.026;0.63 ±0.07比1.31±0.12,P=0.002)表达水平也明显下降.结论 高浓度草酸通过HK-2细胞内ROS的产生激活NLRP3炎症小体,进而通过改变细胞表面黏附性来促进草酸钙肾结石的形成.