端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人肝癌细胞生长抑制的研究

摘要：本实验旨在探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸（ASODN-t）抑制端粒酶活性［1］，诱导肝癌细胞凋亡，从而抑制肝癌细胞生长的作用［2］，为肝癌基因治疗提供依据，现将结果报道如下。　　一、材料和方法　　1. ASODN-t对细胞抑制作用的观察: 取2×107个/L对数生长期肝癌细胞(肝癌细胞株SM MC -7721 引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库)接种于96孔的细胞培养板中，每孔100 μl，设3个复孔。分别加入ASODN-t（上海生工生物工程公司合成，序列为5’-CT CAGTTAGGGTTAGACA-3’,调节其终浓度分别为1、2、3、4、5 μmol/L）、无关寡聚核苷酸（N-ODN，上海生工生物工程公司合成，序列为5’-CATTTCTTGCTCTCCACG- 3’,终浓度为3 μmol/L），培养24、48、72、96 h，于结束前4 h加入质量分数为0. 5%四唑蓝(MTT)20 μl，继续培养4 h，再加入SDS溶液100 μl，终止反应。37 ℃培养箱过夜，用酶联免疫检测仪检测各孔在波长570 nm的吸光度A值。　　2.形态学观察: 在培养状态下，倒置显微镜观察细胞生长状况及形态学改变，并将5 μm ol/L的ASODN-t处理3 d的细胞在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态。　　3.DNA抽提及电泳: 将1×109个/L肝癌细胞经5　μmol/L ASODN-t处理3 d后按试剂盒方法抽提DNA，取抽提好的DNA 5 μl，在质量分数为2.0%琼脂糖凝胶，80 V电压条件下电泳 3 h，紫外光透射仪下观察电泳条带并拍照。　　4.流式细胞仪分析: 将1×109个/L肝癌细胞与5 μmol/L ASODN-t共同孵育3 d，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，加无水乙醇固定24 h，随后清洗细胞，与含有质量分数为1.0% RNA 酶的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）共同孵育10 min，碘化丙啶DNA染色后上机检测。　　5.端粒酶活性测定:同上法肝细胞孵育3 d，按试剂盒要求处理细胞，取反应管，各加入45 μl反应混合物、2 μl已处理的标本，混匀，加入30 μl液体石蜡，置25 ℃水浴保温 30 min，在聚合酶链反应(PCR)仪上循环，94 ℃120 s，94 ℃30 s，48 ℃30 s，72 ℃90 s ，72 ℃300 s。循环35次。循环结束后，在微孔板各孔中加入杂交反应液，再加入扩增产物 25 μl混匀，设立阴阳及空白对照，置37 ℃恒温反应60 min。加入显色剂，37 ℃避光显色 10 min，加入终止液，终止反应。在波长450 nm读取A值。　　二、结果　　1.ASODN-t对细胞生长的影响(图1): 不同浓度ASODN-t与2×107个/L肝癌细胞共同孵育后，细胞生长受到抑制，这一抑制作用随浓度的升高及作用时间的延长而加强。N-ODN（对照组）对肝癌细胞无作用。　　2.细胞形态学变化: 倒置显微镜下可见N-ODN作用的细胞及不加药组细胞呈上皮型贴壁生长，细胞轮廓清楚，细胞间结构紧密，细胞生长旺盛；而ASODN-t组细胞有部分变圆浮起，细胞间接触变松，增殖减慢，细胞中颗粒增多，随药物浓度增高，细胞周围碎片增多，并将5?μmol/L?ASODN-t处理3?d的细胞在荧光显微镜下观察，细胞核染色质深染，聚积于核膜下呈新月形，膜突起呈小泡样，小泡脱落形成含核小体片段的凋亡小体。而N-ODN（对照组）作用的细胞及不加药细胞无明显形态学变化。　　3.DNA电泳结果: 5?μmol/L?ASODN-t作用3?d后，肝癌细胞DNA电泳呈明显凋亡带，对照组则无凋亡带。　　4.流式细胞仪分析结果: 流式细胞仪检测5 μmol/L ASODN-t作用3 d的肝癌细胞在G1 期前出现亚二倍体凋亡峰,对照组未见凋亡峰。　　5.端粒酶活性: 5 μmol/L ASODN-t作用3 d后，肝癌细胞端粒酶活性明显受到抑制(A 值：0.06)，不加药的肝癌细胞及N-ODN作用的细胞粒酶活性很高(A值：0.13、0.14) 。