感觉和运动神经源性雪旺细胞与神经元共培养神经生长因子mRNA的表达

摘要：临床上修复神经缺损使用自体神经移植体时，神经感觉功能恢复较运动功能好，这可能与移植神经取自感觉神经有关，这种神经特异性再生的机制目前认为有多种机制参与［1］，而神经损伤后初雪旺细胞是远段神经的唯一成分，而且雪旺细胞被证实可以分泌包括神经生长因子(NGF)在内的多种神经营养因子［2］，因此我们以感觉和运动神经来源的雪旺细胞为研究对象，以NGF为指标，研究两种雪旺细胞与神经元共培养后NGF mRNA的表达是否有差异，探讨这种差异对神经特异性再生的作用。　　一、材料和方法　　1.雪旺细胞和神经元的体外培养：感觉性和运动性雪旺细胞、感觉和运动神经元的体外共培养参考文献［3，4］的方法。简要步骤如下：无菌条件下，分别取5　d龄SD乳鼠的背根神经(感觉性雪旺细胞)和股神经肌支(运动性雪旺细胞)，14　d龄SD胚鼠背根神经节(感觉神经元)和脊髓前角(运动神经元)，剪碎成糊状；分别置入离心管中，加入0.125%胰蛋白酶+0.03%Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)，消化30～40　min；1 　500 r/min离心5　min；用DMEM/F12(Gibco公司)培养基将沉淀混悬成悬液，接种到培养皿中；37 ℃，体积分数为5%CO2细胞培养箱中孵育；雪旺细胞在48 h添加阿糖胞苷(5×10 -8　μg/L)，抑制成纤维细胞，第4天按1×109个/L的密度传代接种到6孔培养板盖玻片上，2　d后接种原代培养神经元细胞，这样就获得感觉性雪旺细胞和感觉神经元、运动性雪旺细胞和运动神经元的共培养。　　2.共培养细胞NGF mRNA的表达：NGF mRNA表达的检测采用武汉博士德公司原位杂交检测试剂盒(MK1032型)提供的方法进行。简要步骤如下(以下溶液中均含有0.1%焦炭酸二乙酯)： 4%多聚甲醛固定液30　min；磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤3次；甲醇(含体积分数为0.03%过氧化氢)30　min；PBS洗涤3次；灭菌水洗涤3次；蛋白酶K，37 ℃，10　min；灭菌水洗涤3次；地高辛标记的cDNA探针和无关序列在杂交液内首先经过100 ℃，8　min的变性处理，然后置于碎冰中3　min，滴加到盖玻片上，上面覆以专用盖片(Sigma公司)；37 ℃孵育20　h；2 5 ℃的2×SSC(氯化钠17.4　g，柠檬酸钠8.8　g溶于1　000　ml水中)洗涤2次；37 ℃的0.1 ×SSC洗涤1次；加入封闭液，不洗；加入抗地高辛抗体，34 ℃孵育30　min；TBS(氯化钠30 g，三羟甲基氨基甲烷1.2　g，纯乙酸0.5　ml溶于1　000　ml水中)洗涤；加入酶标二抗， 34 ℃孵育20　min；TBS洗涤；加入显色液，34 ℃显色30　min；灭菌水洗涤，中止反应。显微镜下观察、比较。　　二、结果　　感觉和运动雪旺细胞与相应神经元混合培养后，第3天分别进行NGF mRNA原位杂交，图1为运动性雪旺细胞NGF mRNA表达染色，图2为感觉性雪旺细胞的表达，图3为空白对照，图中黑褐色染色颗粒的多寡即代表NGF mRNA表达量的多少。由图中可见，感觉性雪旺细胞NG F mRNA的表达颗粒明显较运动性雪旺细胞密集，而运动性雪旺细胞的表达接近于空白对照。