乳猪肝细胞分离方法的建立

摘要：生物性人工肝作为暴发性肝衰竭的一种治疗手段正在不断的发展，理想的具有完整代谢活性的肝细胞是其关键的组成部分。我们在以往研究的基础上 ［1,2］，建立起一种乳猪肝细胞的分离方法，现报道如下。　　一、材料和方法　　1.液体的配制：(1)细胞分离液配制：A液：含NaCl 120 mmol/L、NaHCO3 25 mmol/L 、KCl 4.8 mmol/L、MgSO4 1.2 mmol/L、KH2PO4 1.2 mmol/L。B液：含CaCl2 1.33 mmol/L、体积分数为1.6%牛血清白蛋白的A液。C液：含葡萄糖5.6 mmol/L、乙二胺四乙酸二钠0.5 mmol/L的A液。D液：含CaCl2 1.25 mmol/L、2.4%牛血清白蛋白、Ⅳ型胶原酶(Si gma公司)0.05%的C液。(2)细胞培养液配制：Williams'E培养液含：胰岛素200 U/L、表皮生长因子10 μg/L、胰高血糖素50 μg/L、氟美松2.5 mg/L、青霉素15万U/L、链霉素100 mg/L。　　2.乳猪肝细胞的分离：新生雄性乳猪，腹正中切口，暴露分离腹主动脉，插管固定，以一定的压力向腹主动脉内推注含肝素(100 U/kg体重)的4 ℃ C液，同时迅速切开胸腔，夹闭胸主动脉剪开心脏，即快速推注C液300 ml，推注同时切开门静脉，插管固定，快速推注4 ℃ C液100 ml。在肾静脉以上水平剪开下腔静脉，插管固定，夹闭肝上下腔静脉，将门静脉插管连接驱动泵输出端，形成门静脉-肝脏-腔静脉循环，循环D液30 min(37 ℃，95%O2，5%CO2)，流速50 ml/min，取下肝脏， B液中轻轻剥离肝包膜，以肝上下腔静脉为中心用小木梳轻轻快速梳下肝细胞，经4层纱布滤过即得较稠厚肝细胞悬液。将肝细胞悬液在4 ℃、50 g条件离心2.5 min，弃上清， 4 ℃ B液洗2次，Willianms'E 培养液洗1次，分别以50 g条件离心2.0、1.5、1.0 min，即得较理想肝细胞悬液。　　3.肝细胞存活率测定：少量肝细胞悬液与等量0.4% 台盼蓝液混合，静置1 min，显微镜下计数200个细胞，细胞核着色者为死细胞，不着色者为活细胞。　　二、结果　　平均肝细胞产量为(12.94±1.29) ml (含肝细胞7×1010个/L)，肝细胞存活率为90.90%。　　光镜下观察，肝细胞形态完整，以单个游离肝细胞存在。　　三、讨论　　和大鼠相比，利用乳猪作为肝细胞来源能提供更多的肝细胞，更适合于实验研究的应用，而且和成熟肝细胞比较，乳猪肝细胞富含肝细胞再生刺激因子（包括肝细胞生长因子、肝源性肝细胞刺激物质及肝细胞生成素），这些因子能在肝细胞培养过程中修复分离时部分受损的肝细胞，从而提高了肝细胞的活性率。更有利于维持肝细胞的活性［3］，这对肝细胞的培养以及应用于生物人工肝比较有利。　　利用含乙二胺四乙酸二钠平衡盐溶液较以往应用生理盐水灌洗，减轻了血细胞的聚集，更有利于祛除血管里的血细胞，使灌洗更充分、彻底，经腹主动脉进入的灌洗液一部分直接入肝，一部分经胃肠道系统循环后入门静脉达肝脏，符合肝脏的生理条件，对肝细胞起保护作用，经腹主动脉、门静脉双重灌洗，较单一血管灌流更均匀、彻底。　　在肝细胞制备过程中维持37 ℃恒温及95%O2、5%CO2混合通气减少了细胞的代谢损伤，这对维持肝细胞的活性非常必要，充分洗涤可以除去残的胶原酶和细胞碎片，减少胶原酶对肝细胞的影响，特别是应用Willianms'E 培养液洗涤，提高肝细胞的存活率。　　本研究结果表明，我们建立的原位胶原酶经腹主动脉、门静脉双重灌洗分离乳猪肝细胞能提供高产量、高活性的肝细胞。