期刊简介
中华医学会主办。本刊是外科学类核心期刊，国家科学技术部中国科技论文统计源期刊，中国生物医学核心期刊，中华医学会外科学分会两本会刊之一，以“探讨理论，更新知识，指导科研，服务临床”为办刊宗旨，其内容包括外科各个专业，是紧密结合临床实践的全国实验外科专业刊物。设有“论坛”、“述评”、“实验研究”、“临床研究”、“新技术与新方法”、“动物模型”、“简报”、“综述”等栏目。创刊28年来，本刊立足外科前沿，评论医学资讯，报道实验外科最新科技成果，内容新颖，信息量大，杂志被引频次与影响因子逐年增加，已成为我国中高级外科医师学术交流的重要园地。
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首页>中华实验外科杂志
- 杂志名称：中华实验外科杂志
- 主管单位：中国科学技术协会
- 主办单位：中华医学会
- 国际刊号：1001-9030
- 国内刊号：42-1213/R
- 出版周期：月刊
期刊荣誉：中国期刊全文数据库(CJFD)期刊收录：CA 化学文摘(美), 国家图书馆馆藏, 维普收录(中), 知网收录(中), JST 日本科学技术振兴机构数据库(日), 统计源核心期刊(中国科技论文核心期刊), CSCD 中国科学引文数据库来源期刊(含扩展版), 万方收录(中), 上海图书馆馆藏, 北大核心期刊(中国人文社会科学核心期刊)
成人肝细胞分离及低温保存的研究
李桂臣；刘永锋；梁健；何三光
关键词：成人肝细胞, 肝细胞分离, 灌注液, 肝脏, 细胞存活率, 透明质酸酶, 再灌注, 胶原酶, 小牛血清, 肝细胞悬液, 肝细胞活力, 方法, 保存, 应用, 细胞内, 获取, 灌洗, 乳酸脱氢酶, 全身肝素化, 腹部多器官
摘要：我们采用改进的胶原酶灌注技术,获取分离的成人肝细胞,并研究威斯康星(UW)保存液对细胞活力和ATP贮存的影响，现将结果报道如下。 一、材料与方法 1.主要试剂：Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、DNA酶I、4-2-羟乙基-1哌嗪乙磺(HEPES)均购自 Sigma公司,离解酶(Dispase)Ⅱ型购自Boehringer公司,小牛血清为Gibco产品。 2.分离方法：成人肝脏取自脑死亡供体，采用腹部多器官联合快速切取技术获取, UW液低温灌洗。切取灌洗较好的肝叶组织60～80 g(1个切面,保留3～4支血管行插管),UW液0～4 ℃保存,冷缺血时间3～8 h。肝脏获取后,以1 000 ml 初灌注液20 ml/min灌注,然后以500 ml再灌注液循环灌注至肝脏彻底消化。用镊子撕掉格林森鞘后取出肝细胞放入含体积分数为10%的小牛血清,质量分数为0.01%的DNA酶Ⅰ和Ⅱ型离解酶及0.8 mmol/L Mg2+的1640培养基中混均，尼龙网过滤。然后4 ℃,50 g离心5 min,以含钙的Hanks液漂洗3次。取细胞悬液台盼兰染色判断细胞存活率(灌注液成分见表1) 。 3.UW液保存：肝细胞悬液50 g离心后去上清,均匀悬于UW液中(含胰岛素 4 IU/L, 地塞米松 16 mg/L,血清及青霉素),4 ℃保存,一定时间后测细胞存活率, HPLC法测细胞内 ATP,生化法测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率。在相应时段取细胞37 ℃水浴中孵育60 min,然后测细胞内ATP。 4.统计学方法：数据以均数±标准差(****±s)表示,采用t检验。 二、结果 肝细胞活力及ATP含量见表2。 三、讨论 我们应用改进的胶原酶循环灌注方法获得了纯度及存活率均较高的成人肝细胞。在切取肝叶前以UW液低温灌洗肝脏,灌注前全身肝素化, 大大减少了肝组织中红细胞的数量,初灌注时应用含乙二醇四乙酸的无钙Hanks液,提高了肝细胞的产量。灌注时用透明质酸酶,使得肝脏基质消化得更彻底, 再灌注时应用DNA酶Ⅰ及离解酶Ⅱ,可以消化坏死的肝细胞释放的DNA，使消化后的肝细胞不能凝结成块。再灌注液中含有Mg2+和Ca2+,可以稳定DNA酶，以发挥更大效果。肝脏灌注过程中产生的一些酸性产物可使灌注液的pH值下降到6.0左右,灌注液中的多数酶发挥作用的佳pH值为7.4,我们在本研究中采用15 mmol/L的H EPES作为缓冲系,可使灌注液的pH值恒定在7.4～7.5之间,而且对肝细胞的毒性很小［1］，以使各种酶类发挥佳消化效果。肝细胞消化完全后格林森鞘很容易撕去,如过度消化则可崩解成碎片。经过以上处理, 可以得到纯度及存活率均较高的肝细胞用于各种研究。
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